Redagavo Peteris Sarnow, Stanfordo universiteto medicinos mokykla, Stanfordo universitetas, Kalifornija, patvirtinta 2020 m. gruodžio 25 d. (peržiūrėta 2020 m. spalio 25 d.)
Mes pranešame apie subvienetų sąveiką replikuojant koronavirusus ir transkripcijos kompleksus, kurie yra būtini replikacijai ir evoliuciniam išsaugojimui.Pateikėme įrodymų, kad NiRAN domenas, susijęs su nsp12, turi nukleozido monofosfato (NMP) transferazės aktyvumą trans ir nustatė nsp9 (RNR surišantį baltymą) kaip tikslą.NiRAN katalizuoja kovalentinį NMP fragmento prisijungimą prie konservuoto nsp9 amino galo reakcijos, kuri priklauso nuo Mn2+ jonų ir gretimų konservuotų Asn liekanų.Nustatyta, kad NiRAN aktyvumas ir nsp9 NMPilinimas yra būtini koronaviruso replikacijai.Duomenys leidžia susieti šį įdėto viruso fermento žymeklio aktyvumą su ankstesniais stebėjimais hipoteze, kad RNR sintezės inicijavimas RNR virusų klasėje yra funkciniu ir evoliuciniu požiūriu nuoseklus.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae ir 12 kitų šeimų) nuo RNR priklausoma RNR polimerazė (RdRps) yra susieta su aminogaliniu (N-galiniu) domenu nestruktūriniame baltyme (nsp), išsiskiriančiame iš poliproteino, vadinamo NiRAN. 1ab sudaro pagrindinė virusinė proteazė (Mpro).Anksčiau buvo pranešta apie arterinio viruso NiRAN-RdRp nsp paties GMPilinimo / UMPilinimo aktyvumą ir buvo pasiūlyta sukurti trumpalaikį nukleozido monofosfato (NMP) perkėlimą į (šiuo metu nežinomą) virusą ir (arba) ląstelių biopolimerizacijos dalykus.Čia parodome, kad koronavirusas (žmogaus koronavirusas [HCoV]-229E ir sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronavirusas 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) turi nuo Mn2+ priklausomą NMPilinimo aktyvumą, kuris yra gaunamas iš nsp9 susidarant Mpro tarpininkaujamam nsp9 po to. N-galo greta esantis nsps yra proteolitiškai atpalaiduojamas, fosforamidatas yra prijungtas prie pirminio amino (N3825) nsp9 N-gale.Uridino trifosfatas yra tinkamiausias nukleotidas šioje reakcijoje, tačiau adenozino trifosfatas, guanozintrifosfatas ir citidino trifosfatas taip pat yra tinkami kosubstratai.Mutacijų tyrimai, naudojant rekombinantinius koronaviruso nsp9 ir nsp12 baltymus ir genetiškai modifikuotus HCoV-229E mutantus, nustatė likučius, reikalingus NiRAN tarpininkaujamai nsp9 NMPylacijai ir viruso replikacijai ląstelių kultūroje.Duomenys patvirtino NiRAN aktyviosios vietos liekanų prognozę ir nustatė svarbų nsp9 N3826 liekanų vaidmenį nsp9 NMPiliavime ir viruso replikacijoje in vitro.Ši liekana yra konservuotos N-galinės NNE tripeptido sekos dalis ir pasirodė esanti vienintelė nekintama nsp9 ir jo homologų liekana koronavirusų šeimoje.Šis tyrimas suteikia tvirtą pagrindą kitų įdėtųjų virusų NMPilinimo aktyvumo funkciniams tyrimams ir siūlo galimus antivirusinių vaistų kūrimo tikslus.
Nidovirales teigiamos grandinės RNR virusas užkrečia įvairius stuburinius ir bestuburius (1, 2).Šiuo metu įsakyme yra 14 šeimų (3), iš kurių koronaviruso šeima buvo plačiai ištirta per pastaruosius 20 metų.Tuo metu trys zoonoziniai koronavirusai atsirado iš gyvūnų šeimininkų ir sukėlė didelio masto sunkių kvėpavimo takų infekcijų protrūkius žmonėms.Įskaitant nuolatines pandemijas, kurias sukelia sunkios ūminės infekcinės ligos.Kvėpavimo sistemos sindromas Koronavirusas 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirusai turi bendrą genomo organizaciją, o su membrana susieto replikacijos-transkripcijos komplekso (RTC) subvienetas yra užkoduotas 5-β2-galo dviejuose trečdaliuose ir pagrindiniame viruso dalelės struktūriniame subvienete, taip pat kai kurie priedai. .Baltymas, užkoduotas 3??² galutiniame genomo trečdalyje (1).Išskyrus vieną planarinių virusų (Monoviridae) šeimą (8), visi įdėtieji virusai koduoja RTC subvienetus dviejuose dideliuose atviruose skaitymo rėmeliuose (ORF) ORF1a ir ORF1b, kurie yra išversti iš genominės RNR.ORF1a koduoja poliproteiną (pp) 1a, o ORF1a ir ORF1b kartu koduoja pp1ab.Bendrai dalyvaujant pagrindinei proteazei (Mpro), koduojamai ORF1a, ir pp1a, ir pp1ab yra proteolitiškai perdirbami į įvairius nestruktūrinius baltymus (nsps), taip pat žinomus kaip 3CLpro, nes turi homologiją su pikornaviruso 3Cpro ( 9).Manoma, kad šie nsps yra sujungti į didelį dinaminį RTC, katalizuoja genominės RNR (replikacijos) ir subgenominės RNR rinkinio (transkripcijos) sintezę ir yra naudojami koordinuoti ORF, esančios pasroviui nuo ORF1b (10? ?12).
Pagrindinis RTC apima nuo RNR priklausomą RNR polimerazę (RdRp) (13), 1 superšeimos helikazę (HEL1) (14, 15) ir keletą RNR perdirbančių fermentų, kurie daugiausia yra koduojami ORF1b ir koronavirusų šeimoje. Jame yra nsp12-nsp16 ir nsp9-nsp12 Arterioviridae šeimoje (žr. 10ââ 12 nuorodą).RdRp ir HEL1 yra du (penktadalis) konservuoti paukščio lizdo viruso domenai ir turi homologiją tarp kitų RNR virusų.Manoma, kad pagrindinę repliką padeda kiti subvienetai, įskaitant keletą mažų nsp, išsiskiriančių iš pp1a karboksigalinio (C-galo) regiono, esančio pasroviui nuo Mpro (atitinkamai koronaviruso nsp5 ir arterinio viruso nsp4).Jie turi ribotą šeimos apsaugą ir įvairią veiklą (peržiūrėta 10ââ12 nuorodoje).
Palyginti neseniai visuose įdėtuose virusuose aminogale (N-gale), esančiame greta RdRp, buvo rastas domenas su unikaliomis sekos motyvo savybėmis, bet nėra kitų RNR virusų (16).Remiantis jo vieta ir nukleotidų transferazės (nukleozido monofosfato [NMP] transferazės) aktyvumu, šis domenas pavadintas NiRAN (su Nestvirus RdRp susijusi nukleotidų transferazė).Dviejų domenų NiRAN-RdRp derinys sudaro nsp12 Coronaviridae šeimoje ir nsp9 Arterioviridae šeimoje, o kitose nestoviridae NiRAN-RdRp bus išleistas kaip nepriklausomas nsp iš viruso poliproteino.Koronaviruso atveju NiRAN domenas turi 1/450 liekanų ir yra prijungtas prie C-galo RdRp domeno per linkerio sritį (16-19).Arklių arterito viruso (EAV) (Arteriviridae) rekombinantinis nsp9 rodo nuo Mn2+ jonų priklausomą (savarankišką) UMPilinimo ir GMPilinimo veiklą, kuri priklauso nuo trijų konservuotų sekos bazių nestoviruse, AN, BN ir CN. Likučių sekoje.Kur N reiškia NiRAN) (16).Šių motyvų N-galas yra mažiau konservatyvus preAN motyvas.Kai kurios iš šių liekanų taip pat yra išsaugotos toli giminingose baltymų kinazėse, kur buvo įrodyta, kad jos dalyvauja nukleozidų trifosfato (NTP) surišime ir kataliziniame aktyvumoje (20, 21).Remiantis šiuo stebėjimu, keletas pagrindinių aktyvių vietų likučių pseudokinazės SelO iš Pseudomonas syringae gali būti surinkti su neseniai paskelbtu SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompleksu.Konservuotos koronaviruso NiRAN liekanos, esančios elektronų mikrostruktūroje.Rekombinantinis baltymas (17).Spėjama, kad dokumentais patvirtintas (savaiminis) U/GMPilinimas sukels laikiną būseną, perkeldama NMP į (šiuo metu nežinomą) substratą (16), o NiRAN ir baltymų kinazės struktūrinis panašumas (17, 19) ) Ar hipotezė, kad NiRAN modifikuoja kitus baltymus.
Dėl daugelio savybių, įskaitant jo unikalų ir unikalų sisteminį ryšį su įdėtais virusais ir genetinį atskyrimą nuo RdRp, NiRAN yra pagrįstas pagrindinis reguliuojamasis fermentas įdėtiems virusams, kuris yra labai svarbus jų atsiradimui ir tapatybei.Anksčiau buvo vadinamos trys galimos funkcijos, apimančios NiRAN, reguliuojančios genomą / subgenominį vertimą arba replikaciją / transkripciją.Atsižvelgiant į tuo metu turimus ribotus ir neišsamius duomenis, kiekviena funkcija turi savo privalumų ir trūkumų (16).Šiame tyrime mes siekiame sujungti biocheminius ir atvirkštinius genetinius koronavirusų, atstovaujančių dviem gentims, tyrimus ir savo išvadas įtraukti į natūralios koronavirusų šeimos mutacijos evoliucinį foną, kad gautume įžvalgos apie šią paslaptingąją sritį.Mes pranešame apie didelę pažangą suprantant NiRAN, nustatydami natūralius taikinius RTC, o tai (tarp trijų galimų hipotezių) prisideda prie šio domeno vaidmens inicijuojant įdėto viruso RNR sintezę.Šis tyrimas taip pat atveria galimybes atlikti kitus NiRAN vaidmenis viruso šeimininko sąsajoje.
Siekdami apibūdinti su koronaviruso nsp12 susijusio NiRAN domeno fermentines savybes, mes sukūrėme rekombinantinę žmogaus koronaviruso 229E (HCoV-229E) nsp12 formą E. coli su His6 žyma C-gale ir sujungėme baltymas su [α32-P ] Inkubuokite kartu su NTP, esant MnCl2, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai.Reakcijos produkto analizė parodė, kad yra radioaktyviai pažymėto baltymo, migruojančio kartu su nsp12 (106 kDa), o tai rodo, kad koronavirusas nsp12 katalizuoja kovalentinių baltymo-NMP aduktų susidarymą, kurie pirmiausia susidaro su uridino monofosfatu (UMP) (1A pav.) B).Kiekybinė analizė parodė, kad, palyginti su kitais nukleotidais, UMP įtraukimo signalo intensyvumas padidėjo 2–3 kartus (1C pav.).Šie duomenys atitinka prognozuojamą koronaviruso NiRAN domeno NMP transferazės aktyvumą (16), tačiau rodo, kad koronaviruso ir arterinio viruso NiRAN domeno nukleotidų nuostatos skiriasi.
HCoV-229E nsp12 savaiminio NMPilinimo aktyvumas.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) buvo inkubuojamas su nurodytu [α-32P] NTP, dalyvaujant 6 mM MnCl2, 30 minučių (išsamiau žr. Medžiagos ir metodai).Reakcijos produktai buvo atskirti SDS-PAGE ir nudažyti Coomassie briliantine mėlyna spalva.(B) Radioaktyviai pažymėtas baltymas vizualizuojamas fosforo vaizdavimu.Nsp12-His6 ir baltymų molekulinės masės žymenų (kilodaltonais) padėtys parodytos A ir B. (C) Radioaktyvaus signalo intensyvumas (vidurkis ± SEM) buvo nustatytas iš trijų nepriklausomų eksperimentų.*P≤0,05.Signalo stiprumas (procentais) yra susijęs su UTP.
Nors buvo įrodyta, kad su NiRAN susijęs fermentų aktyvumas yra būtinas EAV ir SARS-CoV replikacijai ląstelių kultūroje (16), specifinė NiRAN funkcija ir galimi taikiniai dar nenustatyti.Neseniai praneštas struktūrinis NiRAN ir baltymų, turinčių į baltymų kinazę panašių raukšlių, šeimos panašumas (17, 22) paskatino mus patikrinti hipotezę, kad NiRAN katalizuoja kitų baltymų NMPilinimą.Sukūrėme potencialių homologinių taikinių rinkinį, įskaitant nestruktūrinius baltymus, koduotus HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), kurių kiekvienas turi C-galo His6 žymą (SI priedas, S1 lentelė). inkubuokite šiuos baltymus su [α32-P] uridino trifosfatu ([α32-P]UTP), kai yra nsp12 arba jo nėra.Galvijų serumo albuminas ir MBP-LacZα sulietas baltymas, pagamintas E. coli, buvo kontroliniai mėginiai (2A pav., 1–7 juostos).Radioaktyviai pažymėtas baltymas buvo ištirtas natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze (SDS-PAGE) ir autoradiografija, ir buvo nustatyta, kad reakcijoje, kurioje yra nsp12 ir nsp9, buvo stiprus radioaktyvus signalas.Signalo padėtis atitinka nsp9 molekulinę masę, o tai rodo nsp12 tarpininkaujantį nsp9 UMPilinimą (2B pav., 7 takelis).Jokie kiti tiriamieji baltymai nebuvo UMPilinti, todėl padarėme išvadą, kad nsp9 yra specifinis nsp12 substratas.Remiantis 1 paveiksle parodytais savarankiško NMPilinimo duomenimis, nsp12 gali perkelti visus keturis NMP į nsp9, nors efektyvumas skiriasi, UMP> adenozino monofosfatas (AMP)> guanozino monofosfatas (GMP)> citidino monofosfatas (CMP)) Paveikslėlis).3 A ir B).Šiame tyrime naudojamomis sąlygomis (sutrumpinkite reakcijos ir ekspozicijos laiką, sumažinkite nsp12 koncentraciją; medžiagos ir metodai), nsp12 savaiminio NMPilinimo nepavyko aptikti (palyginkite 2B paveikslą, 7 juostą ir 1B paveikslą). pasirodė veiksmingas (ir kelis raundus) UMP perkeltas iš nsp12 į nsp9.UMP transferazės aktyvumui reikalingas Mn2+ jonų buvimas, kaip parodyta 3C paveiksle, o esant Mg2+ buvo pastebėtas tik minimalus UMP transferazės aktyvumas, o kitų dviejų tirtų dvivalenčių katijonų aktyvumo nėra.Panašūs duomenys buvo gauti atliekant NMPilinimo tyrimus, kuriuose yra citidino trifosfato (CTP), guanozino trifosfato (GTP) ir adenozino trifosfato (ATP) (SI priedas, S1 pav.).
HCoV-229E nsp12 tarpininkaujantis nsp9 UMPilinimas.Baltymų substratų serija (įskaitant galvijų serumo albuminą, MBP-lacZα ir seriją HCoV-229E nsps, pažymėtų C-galo His6, koduojamu ORF1a), buvo naudojama HCoV-229E nsp12-His6⁺ tarpininkaujamo UMPilinimo aktyvumui įvertinti. baltymas.Inkubuokite baltymą su [α-32P] UTP 10 minučių, kai nsp12 nėra (A) arba nėra (B), kaip aprašyta medžiagose ir metoduose.A ir B viršuje rodomas SDS-poliakrilamido gelis, nudažytas Coomassie Brilliant Blue, o A ir B apačioje - atitinkamos autoradiogramos.Baltymų molekulinės masės žymeklio padėtis (kilodaltonais) nurodyta kairėje.Taip pat nurodoma nsp12-His6 padėtis (B, viršuje) ir radioaktyvus signalas, pastebėtas inkubuojant nsp12-His6 su nsp9-His6 (B, 7 juosta), o tai rodo, kad [α-32P]UMP į nsp9-His6 (12,9 kDa), kuris nebuvo pastebėtas kitiems tirtiems baltymams.
HCoV-229E NiRAN sukeltas biocheminis ir virusologinis nsp9 NMPilinimo apibūdinimas.(A ir B) Reakcijoje naudojamo nukleotido kosubstrato vaidmuo.Nsp12-His6 ir nsp9-His6 sumaišomi ir inkubuojami esant skirtingiems [α-32P] NTP standartiniame NMPilinimo tyrime.(A, viršuje) Coomassie dažytas nsp9-His6, atskirtas SDS-PAGE.(A, apačioje) Tos pačios gelio srities autoradiografija.(B) Santykinis aktyvumas (vidurkis ± SEM) esant nurodytam nukleotidų kofaktoriui nustatomas iš trijų nepriklausomų eksperimentų.*P≤0,05.(C) Metalo jonų vaidmuo.Parodytas standartinis NMPilinimo testas, kai yra [α-32P] UTP ir skirtingi metalo jonai, kurių kiekvieno koncentracija yra 1 mM.C rodomas viršuje, Coomassie dažytas nsp9-His6, o C apačioje - atitinkama autoradiografija.Pažymėto baltymo dydis (kilodaltonais) rodomas kairėje nuo A ir C. (D) HCoV-229E nsp12-His6 mutantinė forma, turinti nurodytą aminorūgščių pakaitalą, yra [α-32P]UTP, kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“.Radioaktyviai pažymėtas nsp9-His6, susidaręs NMPilinimo reakcijos metu, aptinkamas fosforilinimo vaizdavimu (D, viršuje).Santykinis aktyvumas, palyginti su laukinio tipo (wt) baltymu, parodytas D, o apačia paimta kaip vidurkis (± SEM) iš trijų nepriklausomų eksperimentų.Žvaigždutės žymi nekonservuotų likučių pakaitus.(E) Viruso titras p1 ląstelių kultūros supernatante, gautame praėjus 24 valandoms po užsikrėtimo, buvo nustatytas apnašų tyrimu.Nurodomi kodono pakaitalai sukurto HCoV-229E mutanto NiRAN domene (likučių numeracija pagrįsta jų padėtimi pp1ab).Replikacijos stokojantis RdRp aktyviosios vietos mutantas nsp12_DD4823/4AA buvo naudojamas kaip kontrolė.
Siekdami giliau suprasti aktyviąją NiRAN vietą ir nustatyti likučius, susijusius su nsp9 specifinės NMP transferazės aktyvumu, atlikome mutacijų analizę, kurioje pakeitėme konservatyvias liekanas NiRAN AN, BN ir CN motyvuose ( 16) Tai Ala (SI priedas, S2 pav.).Be to, dviem atvejais buvo įvertintas konservatyvių Arg-Lys arba Lys-to-Arg pakeitimų poveikis.Kaip (neigiama) kontrolė, likučiai, kurie nėra arba mažiau konservuoti koronavirusų ir kitų įdėtų virusų NiRAN domene, pakeičiami Ala. Pakeičiant K4116A (motyvas preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motyvas). BN) ir D4280A (CN) žymiai sumažina arba net pašalina nsp9 NMPilinimą per nsp12, o baltymai su konservatyviais pakaitalais (R4178K), K4116R) išlaiko 60% ir 80% savo aktyvumo, o tai rodo, kad sušvelninti jų atitinkamos pusės apribojimai. grandinės yra fizikiniu ir cheminiu požiūriu jautrios (3D pav.).Kelių kitų konservuotų E4145A, D4273A, F4281A ir D4283A likučių pakeitimas yra daug mažiau kenksmingas, o nsp9 UMPylation sumažėja tik vidutiniškai.Panašūs rezultatai buvo gauti atliekant nsp9 NMPilinimo reakcijas, kuriose dalyvavo kiti NTP (3D pav. ir SI priedas, S3 pav.), patvirtinantys, kad pastebėtas poveikis specifiniams aminorūgščių pakaitalams nepriklauso nuo naudojamo nukleotidų kosubstrato tipo.Toliau išbandėme galimą šių nsp12 pakeitimų poveikį koronavirusų replikacijai ląstelių kultūroje.Šiuo tikslu mes panaudojome tinkamus genetiškai modifikuotus komplementariosios DNR (cDNR) šablonus, klonuotus rekombinantiniame vakcinijos viruse (23, 24), kad perrašytume 5–7 ląsteles.Šiose ląstelėse pagamintų infekcinių virusų palikuonių titravimas parodė, kad dauguma HCoV-229E NiRAN mutantų nebuvo įmanomi (3E pav.).Į negyvybingų virusinių mutantų grupę įeina alternatyvos, kurios, kaip įrodyta, pašalina arba žymiai sumažina NMP transferazės aktyvumą in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), tačiau yra dar dvi alternatyvos (K4116R, E4145A). % rezervuota?Jų in vitro NMPilinimo aktyvumas rodo, kad yra papildomų apribojimų.Panašiai dvi kitos mutacijos (R4178K, F4281A), kurios sukėlė nedidelį NiRAN in vitro NMPilinimo aktyvumo sumažėjimą, sukėlė gyvus virusus, tačiau šie virusai replikacijos būdu žymiai sumažino titrus.Remiantis 3D pav. parodytais in vitro aktyvumo duomenimis, pakeitus keturias kitas liekanas, kurios nėra konservuotos koronaviruse ir (arba) kituose įdėtuose virusuose (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), atsirado gyvybingų virusų. Palikuonys, nepaisant to, kad turėjo vidutiniškai sumažintas titras, palyginti su laukinio tipo virusu (3E pav.).
Siekiant ištirti, ar NiRAN sukeltos NMP transferazės aktyvumas priklauso nuo aktyvaus RdRp domeno, dvi konservuotos Asp liekanos, dalyvaujančios dvivalenčių metalų jonų koordinavime (11), RdRp motyve C buvo pakeistos Ala. Gautas baltymas nsp12_DD4823/4AA išlaikomas. jo nsp9 NMPilinimo aktyvumas, o tai rodo, kad nsp12 sukeltam in vitro nsp9 NMPilinimo aktyvumui nereikia polimerazės aktyvumo (SI priedas, S4 pav.).
Nustačius nsp9 specifinį NMP transferazės aktyvumą nsp12, bandėme apibūdinti NMP-nsp9 aduktą masės spektrometrija (MS).Visas rekombinantinio HCoV-229E nsp9 baltymų masės spektras parodė smailę ties 12 045 Da (4A pav.).Nsp12 pridėjimas nepakeitė nsp9 kokybės, o tai rodo, kad nsp12 ir nsp9 nesudarys stabilaus komplekso esant naudotoms sąlygoms (denatūracija) (4A pav.).Esant UTP ir GTP, reakcijos, turinčios atitinkamai nsp9 ir nsp12, masės matavimas parodė, kad UTP baltymų masė pasislinko 306 Da, o GTP baltymų masė – 345 Da, o tai rodo, kad kiekviena nsp9 molekulė jungiasi su UMP arba GMP. (4 pav.) C ir D).Spėjama, kad energija, reikalinga NiRAN tarpininkaujamam nsp9 NMPilinimui, gaunama iš NTP hidrolizės ir pirofosfato išsiskyrimo.Nors šioje reakcijoje buvo naudojamas 10 kartų molinis nsp9 (taikinio) perteklius nei nsp12 (fermentas), buvo pastebėtas beveik visiškas nsp9 NMPilinimas, o tai rodo, kad nsp12 ir nsp9 sąveika yra trumpalaikė, o nsp12 gali NMPilinti daugiau nsp9. in vitro molekulė.
Vienkartinis nsp9 NMPilinimas, esant nsp12 ir UTP arba GTP.Parodytas pilnas HCoV-229E nsp9 baltymų masės spektras (SI priedas, S1 lentelė) (AD).(A) atskirai nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6, kai yra UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6, kai yra GTP.
Norint nustatyti nsp9 likučius, UMPilintas nsp12, nsp9-UMP buvo suskaidytas tripsinu.Gauti peptidai buvo atskirti nano didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) ir analizuojami tandeminės masės spektrometrijos (MS/MS) būdu internete.Duomenų analizė naudojant Byonic programinės įrangos paketą (Protein Metrics) parodė N-galinės aminorūgšties UMPilinimą.Tai patvirtinama rankiniu būdu.Tandeminis pirmtako peptido [UMP] NNEIMPGK masių spektras (SI priedas, S5A pav.) atskleidė fragmentą esant 421 m/z, o tai rodo, kad UMP prisijungia prie nsp9 1 liekanos.
Nsp9 N gale Asn yra išsaugotas tarp Orthocoronavirinae narių (SI priedas, S6 pav.).Nors manome, kad N-galo pirminis aminų azotas yra labiausiai tikėtinas UMP akceptorius, nusprendėme gauti papildomų įrodymų, kad NMP prisijungia N-gale.Dėl šios priežasties ne NMPilintas ir NMPilintas N-galinis peptidas nsp9, išgrynintas HPLC, buvo gautas dalyvaujant acetonui ir natrio cianoborohidridui.Tokiomis sąlygomis tik laisvieji pirminiai aminai gali būti modifikuoti propilu (25).N-galo nsp9 gautas peptidas, kurio seka NNEIMPGK, turi du pirminius aminus, vieną Asn N gale, o kitą Lys šoninėje grandinėje C gale.Todėl propilo grupės gali būti įvestos abiejuose galuose.Ne NMPilintų peptidų išskirtos jonų chromatogramos parodytos SI priede, S5B paveiksle.Kaip ir tikėtasi, galima nustatyti N-galo ir C-galo (mono)propilintus (SI priedas, S5B paveikslas, viršutinė juosta) ir dipropilintus peptidus (SI priedas, S5B paveikslas, apatinė juosta).Šis modelis keičiasi naudojant NMPiluotą N-galinį nsp9 peptidą.Šiuo atveju galima identifikuoti tik C-galo propiluotus peptidus, bet N-galo propilinti peptidai ir dipropilinti peptidai nenustatyti (SI priedas, S5C pav.), o tai rodo, kad UMP buvo perkeltas į N-galo pirminį aminą. grupę nuo pakeitimų.
Tada pakeičiame (su Ala arba Ser) arba ištriname konservuotus likučius nsp9 N gale, kad apibrėžtume specifinius taikinio apribojimus.Remdamiesi mūsų MS duomenimis, rodančiais, kad NiRAN sudaro nsp9-NMP aduktą su nsp9 N-galo liekanos pirminiu aminu, iškėlėme hipotezę, kad nsp9 NMPilinimas reikalauja, kad viruso pagrindinė proteazė (Mpro, nsp5) atpalaiduotų nsp9 N-galą iš jo poliproteino pirmtakas.Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes pagaminome pirmtakų baltymą nsp7-11, turintį nsp9 E. coli, ir atlikome standartinį NMPilinimo testą dalyvaujant [α-32P] UTP (medžiagos ir metodai).Kaip parodyta 5A paveiksle (3 juosta), nesupjaustytas nsp7-11 pirmtakas nėra radioaktyviai pažymėtas nsp12.Priešingai, jei nsp7-11 suskaido rekombinantinis nsp5, kad iš pirmtako išsiskirtų nsp9 (ir kiti nsp), aptinkamas radioaktyviai pažymėtas baltymas, migruojantis su nsp9, patvirtinantis mūsų išvadą, kad NiRAN ir N-selektyvus kovalentinių nsp9-NMP aduktų susidarymas. .Galutinis pirminis N-galo Asn aminas (3825 padėtis pp1a/pp1ab).Šią išvadą taip pat patvirtina eksperimentai, naudojant nsp9 konstrukciją, kurios N gale yra viena ar dvi papildomos liekanos.Abiem atvejais NiRAN sukeltas nsp9 UMPylavimas buvo panaikintas (SI priedas, S7 pav.).Tada mes pagaminome baltymą su viena ar dviem Asn liekanomis, išbrauktomis iš 3825-NNEIMPK-3832 peptidų sekos nsp9 N-gale.Abiem atvejais nsp9 UMPylacija buvo visiškai užblokuota (5B pav.), Suteikdama papildomų įrodymų, kad tikrasis nsp9 N galas veikia kaip NMP receptorius.
Proteolitinis nsp9 apdorojimas ir N-galinių liekanų vaidmuo nsp12 tarpininkaujant UMPylation.(A) nsp9 UMPylacijai reikalingas laisvas nsp9 N terminalas.Nsp7-11-His6 iš anksto inkubuojamas 30 ° C temperatūroje NMPilinimo aptikimo buferyje, kuriame yra UTP, esant rekombinantiniam Mpro (nsp5-His6) arba jo nėra.Po 3 valandų pradėkite NMPilinimo testą, pridėdami nsp12-His6, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai.Reakcija, kurioje yra nsp5-His6 (1 juosta) ir nsp9-His6 (2 juosta), buvo naudojama kaip kontrolė.Po 10 minučių reakcija buvo nutraukta ir reakcijos mišinys atskirtas SDS-PAGE.Baltymas buvo nudažytas Coomassie Brilliant Blue (A, viršuje).Nsp7-11-His6 pirmtakas ir apdorotas produktas, susidaręs dėl nsp5-His6 tarpininkaujamo skilimo, rodomi dešinėje.Atkreipkite dėmesį (dėl jų mažo dydžio), kad nsp7 ir nsp11-His6 šiame gelyje neaptinkami, o reakcija papildyta nsp5-His6 (1 ir 4 juostos; nsp5-His6 padėtis pažymėta vientisu apskritimu) arba nsp9-His6 (2 juosta) yra nedidelis kiekis MBP (pažymėtas atvirais apskritimais) kaip likutinių priemaišų, nes jos yra išreikštos kaip MBP sulieti baltymai (SI priedas, S1 lentelė).(B) Nsp9-His6 variante trūksta vienos ar dviejų N-galo Asn liekanų (likučių numeracija pagal pp1a / pp1ab padėtį), jis yra išgrynintas ir inkubuojamas su nsp12-His6 ir [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE, nudažytas Coomassie, rodomas viršuje, B, atitinkamas autoradiografas rodomas apačioje.Molekulinės masės žymeklio padėtis (kilodaltonais) rodoma kairėje.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-galinės konservuotos liekanos buvo pakeistos Ala arba Ser, o toks pat baltymų kiekis buvo naudojamas nsp12-His6 tarpininkaujančioje UMPylation reakcijoje.Reakcijos produktai buvo atskirti SDS-PAGE ir nudažyti Coomassie Brilliant Blue (C, viršuje), o radioaktyviai pažymėtas nsp9-His6 buvo aptiktas fosforescenciniu vaizdu (C, viduryje).Naudojant laukinio tipo (wt) baltymą kaip atskaitą (nustatytas į 100%), santykinis NMPilinimo aktyvumas (vidurkis ± SEM) buvo apskaičiuotas iš trijų nepriklausomų eksperimentų.(D) Viruso titrai Huh-7 ląstelių, užkrėstų HCoV-229E laukinio tipo Huh-7 ląstelėmis, ir mutantų, turinčių nurodytų aminorūgščių pakaitalų nsp9, p1 ląstelių kultūros supernatante, buvo nustatyti apnašų tyrimu.Kaip neigiama kontrolė buvo naudojamas replikacijos trūkumas RdRp motyvo C dvigubas mutantas DD4823/4AA.
Nsp9 N galas (ypač 1, 2, 3 ir 6 pozicijos) yra labai konservuotas tarp Orthocoronavirinae pošeimos narių (SI priedas, S6 pav.).Norint ištirti galimą šių likučių vaidmenį nsp12 tarpininkaujamame nsp9 NMPiliavime, dvi iš eilės Asn liekanos nsp9 N gale buvo pakeistos Ala arba Ser (atskirai arba kartu).Palyginti su laukinio tipo nsp9, pakeitus N3825 Ala arba Ser, nsp12 sukeltas UMPilinimas sumažėjo daugiau nei du kartus (5C pav.).Atsižvelgiant į mūsų išvadą, kad NMPilinimas vyksta N-galo pirminiame amine, o ne N-galo liekanos šoninėje grandinėje, mes pastebėjome reikšmingą likutinį NMPilinimą pakeitus N3825A ir N3825S.Įdomu tai, kad jei antrasis Asn pakeičiamas Ala arba Ser, nsp9 UMPilinimas sumažėja stipriau (daugiau nei 10 kartų), o Ala pakeitimas 3, 4 ir 6 pozicijose turi tik vidutinį poveikį nsp9 UMPylacijai (2 pav. ).5C).Panašūs rezultatai gauti naudojant ATP, CTP arba GTP (SI priedas, S8 pav.).Visi šie duomenys rodo pagrindinį N2826 (nsp9 2 padėtis) vaidmenį nsp9 NMPiliavime.
Siekdami gauti papildomų įrodymų apie funkcinę koreliaciją tarp nsp9 N-galo ir NMPilinimo, atlikome koronavirusų šeimos nsp9 sekos kelių sekų suderinimą (MSA) (kinta nuo 104 iki 113 liekanų) (SI priedas, pav. S6).Iš viso 47 (žinomose ir spėjamose) rūšyse iš 5 Orthocoronavirinae pošeimio genčių, kurios užkrečia skirtingus žinduolius, paukščius ir roplių šeimininkus, iš viso buvo nustatyta, kad tik 8 liekanos yra nekintamos.Didžiausi pokyčiai, įskaitant ištrynimus ir intarpus, buvo pastebėti cikluose tarp nsp9 antrinės struktūros elementų, kaip nustatyta ankstesniais struktūriniais tyrimais (26–28).Penkios nekintamos liekanos buvo rastos nsp9 C-galinės dalies β grandinėje ir α spirale.Trys nekintamos liekanos sudaro nsp9 N galo NNE motyvą.Atskleidžiama, kad antrasis šio motyvo Asn yra vienintelė nekintama liekana, kurią taip pat dalijasi hipotetinis toli giminingo varlės koronaviruso nsp9, ir atstovauja Microhyla letovirus 1 rūšiai Alphaletovirus Letovirinae pošeimyje.Likučių išsaugojimas nsp9 antrinės struktūros elementuose gali būti racionalizuotas struktūriniais sumetimais, siekiant išlaikyti lankstymo arba žinomas RNR surišimo savybes.Tačiau atrodo, kad šis samprotavimas netaikomas NNE išsaugojimui, o prieš šį tyrimą apribojimų, ribojančių tripeptidų sekos variaciją, pobūdis buvo visiškai neaiškus.
Siekdami nustatyti nsp9-NMPilinimo ir NNE išsaugojimo svarbą koronaviruso replikacijoje, sukūrėme HCoV-229E mutantus, kurie turi vienkartinius arba dvigubus nsp9 N-galinių liekanų pakaitus, o tai rodo, kad nsp9 NMPilinimas yra žalingas in vitro .Prieš pradėdami, bandome atsakyti į klausimą, ar šie pakeitimai (šalia nsp8 | 9 skilimo vietos) turi įtakos C-galo pp1a srities proteolitiniam apdorojimui.nsp7-11 poliproteino konstrukcijų rinkinys, turintis atitinkamus pakaitalus nsp9 N-gale, buvo pagamintas E. coli ir supjaustytas rekombinantiniu Mpro.Keturių vietų (įskaitant nsp9 besiribojančią vietą) proteolitiniam skilimui neturi didelės įtakos jokie įvesti pakaitalai (SI priedas, S9 paveikslas), išskyrus struktūrinius šių baltymų pokyčius, kurie trukdo Mpro tarpininkaujamam nsp8|9 skilimui (ar kita). Interneto svetainė.
Huh-7 ląstelės buvo transfekuotos genomo ilgio HCoV-229E RNR, koduojančia Ala arba Ser pakaitalus konservuotuose NNE tripeptiduose (N3825, N3826 ir E3827) nsp9 N gale, o tai rodo, kad dauguma mutacijų yra mirtinos.Mums pavyko išgelbėti virusą, pakeisdami N-galo Asn Ser arba Ala (N2835A arba N2835S), tačiau nepavyko atkurti viruso su kitomis NNE sekos viengubomis ir dvigubomis mutacijomis (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (5D pav.).
Šie rezultatai rodo, kad koronavirusų replikacija audinių kultūroje yra apribota (tokia pati arba panaši), riboja natūralią nsp9 NMPilinimo vietų mutaciją organizme ir palaiko pagrindinį šio atsako vaidmenį koronavirusų gyvavimo cikle.
Paskutiniame eksperimentų rinkinyje mes pagaminome C-galo His6 pažymėtą SARS-CoV-2 nsp12 ir nsp9 ir dvi mutantines nsp12 formas E. coli.Aktyvios vietos liekanos NiRAN ir RdRp domenuose buvo atitinkamai naudokite Ala (6A pav. ir SI priedas, S2 lentelė).K4465 SARS-CoV-2 nsp12 atitinka K4135 HCoV-229E (SI priedas, S2 pav.), kuris pasirodė reikalingas NiRAN aktyvumui ir HCoV-229E replikacijai (3D ir E pav.).Ši liekana taip pat atitinka arterinio viruso EAV nsp9 K94 likutį, kuris anksčiau buvo įrodytas kaip reikalingas NiRAN savaiminiam UMPiliavimui / savęs GMPylacijai (16).Kaip parodyta 6B paveiksle, SARS-CoV-2 nsp12 turi UMP transferazės aktyvumą, naudojant nsp9 kaip substratą, o nsp12_K4465A aktyviosios vietos mutantas yra neaktyvus.Dvigubas pakeitimas SDD būdingoje RdRp motyvo C sekoje neturi įtakos UMP transferazės aktyvumui (6B pav.), o tai rodo, kad RdRp aktyvumas neturi tiesioginio poveikio nsp9 UMPylacijai.Panašūs duomenys gauti naudojant CTP, GTP ir ATP (SI priedas, S10 pav.).Apibendrinant galima pasakyti, kad šie duomenys rodo, kad NiRAN sukeltas nsp9 NMPilinimas turi konservatyvų aktyvumą koronavirusuose, atstovaujančiuose skirtingoms ortokoronavirusų pošeimos gentims.
SARS-CoV-2 nsp12 tarpininkaujantis nsp9 NMPilinimas.(A) Coomassie dažytas SDS-poliakrilamido gelis, kuriame parodytas rekombinantinis baltymas, naudotas NMPilinimo teste.Kaip kontrolė buvo naudojamas mutantinis baltymas su aktyvios vietos pakaitalu SARS-CoV-2 nsp12 NiRAN domene (K4465A) ir RdRp domene (DD5152/3AA).Likučių numeracija pagrįsta padėtimi pp1ab.(B) UMPilinimo aptikimo autoradiografija naudojant nsp9-His6 ir [α-32P]UTP kaip nsp12-His6 substratą (laukinio tipo [wt] ir mutantas).Pažymėto baltymo molekulinė masė (kilodaltonais) rodoma kairėje pusėje.
NiRAN domenai paprastai yra konservuoti Nidovirales (16), o tai rodo, kad jie katalizuoja fermentines reakcijas, būtinas Nidoviruso replikacijai.Šiame tyrime mums pavyko įrodyti, kad koronaviruso NiRAN domenas perkelia NMP (sugeneruotą iš NTP) į nsp9, paslaptingą RNR surišantį baltymą, dalyvaujantį viruso replikacijoje (26 ?? 29 ), kad nustatytų jį kaip natūralų taikinį ir koronaviruso RTC partneris.
NiRAN domenas dalijasi trimis sekos motyvais (AN, BN ir CN), kuriuose yra labai nedidelis likučių skaičius, kurie yra konservuoti visose šeimose pagal monofilinę, bet labai diferencijuotą Nidovirales tvarką (8, 16).Naujausi tyrimai parodė, kad jie yra struktūriškai susiję su iš esmės nebūdinga baltymų kinazės tipo baltymų šeima, kuri iš pradžių buvo vadinama SelO šeima (17, 19, 22, 30, 31).Su SelO susiję baltymai turi kinazės raukšles, tačiau klasikinėse kinazėse neturi kelių konservuotų aktyviųjų vietų likučių (22, 32).Remiantis atvirkštine ATP molekulių, susietų su aktyvia vieta ir stabilizuota specifine sąveika, orientacija, buvo iškelta hipotezė ir patvirtinta, kad SelO perneša AMP (vietoj fosfato) į baltymo substratą (22), o kitas į SelO panašus bakterinis baltymas YdiU turi. Neseniai buvo įrodyta, kad jis katalizuoja kovalentinį UMP prisijungimą prie skirtingų baltymų substratų Tyr ir His likučių (33).
Siekdami patvirtinti ir išplėsti numanomą koronaviruso NiRAN domeno aktyviosios vietos liekanų prognozę, naudojome biocheminius ir atvirkštinės genetikos metodus, kad atliktume koronaviruso nsp12 mutacijų analizę (3D pav. ir E bei SI priedas, S3 paveikslas ir lentelė) S1â. S4).Duomenys rodo, kad HCoV-229E K4135, R4178 ir D4280 pakeitimas Ala pašalina NMP transferazės aktyvumą in vitro ir viruso replikaciją ląstelių kultūroje (3D pav. ir E bei SI priedai, S3 pav.), tai patvirtina jų buvimą NTP γ-fosfate. ( K4135, R4178) ir aktyvios vietos metalo jonų koordinavimą (D4280).Įrodyta, kad konservuoto Glu E4145A pakaitalas paukščio lizdo viruso diapazone, kuris, kaip prognozuojama, stabilizuos K4135 (17) padėtį, pašalina viruso replikaciją, tačiau stebėtinai aktyvumas išliko atliekant NMPilinimo tyrimą in vitro (3D ir E pav. SI priedas, S3 pav. ir S1–S4 lentelės).Panašus pastebėjimas buvo atliktas, kai atitinkamas pakaitalas buvo įvestas į Salmonella typhimurium (E130A) YdiU homologą (33).Kartu šie duomenys patvirtina šio konservuoto likučio reguliavimo funkciją, o ne katalizinę funkciją.
Pakeitus konservuotą Phe liekaną (F4281A) nestoviruso diapazone HCoV-229E NiRAN domene (8), sumažėjo NMPilinimo aktyvumas in vitro ir reikšmingai sumažėjo viruso replikacija ląstelių kultūroje (3D pav., E ir SI) priedas, S3 pav.).Duomenys atitinka svarbią šios liekanos reguliavimo funkciją, pvz., Homologinį DFG motyvo Phe likutį, parodytą anksčiau.Klasikinėse proteinkinazėse jis yra Mg2+ surišimo kilpos dalis ir padeda surinkti bei reguliuoti stuburą???Reikalingas efektyviam kataliziniam aktyvumui (32, 34).K4116 liekanų (preAN motyve) pakeitimas Ala ir Arg atitinkamai pašalino viruso replikaciją ir, kaip tikėtasi, turėjo skirtingą poveikį NMP transferazės aktyvumui in vitro, priklausomai nuo įvestos aminorūgščių šoninės grandinės (3D pav., E ir SI priedai). , S3 pav.).Funkciniai duomenys atitinka struktūrinę informaciją, o tai rodo, kad šis likutis sąveikauja su ATP fosfatu (17).Kitų įdėtųjų virusų šeimų NiRAN domene HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 vietą užima Lys, Arg arba His (8), o tai rodo, kad šios specifinės liekanos funkcinis apribojimas buvo sušvelnintas.D4188A ir D4283A pakeitimas pašalina arba stipriai sumažina fermentų aktyvumą ir pašalina viruso replikaciją (3 pav.).Šios dvi liekanos yra išsaugotos daugumoje (bet ne visuose) įdėtųjų virusų (8), o tai rodo svarbią šeimai būdingą, bet galbūt ne katalizinę funkciją.Kaip kontrolė buvo naudojami kelių kitų Lys ir Asp liekanų (K4113A, D4180A, D4197A ir D4273A), kurios nėra konservuotos Coronaviridae ar kitose Nestioviridae šeimose (8), Ala pakaitalai.Kaip ir tikėtasi, šie pakeitimai iš esmės yra toleruojami, kai kuriais atvejais šiek tiek sumažėja fermentų aktyvumas ir viruso replikacija (3 pav. ir SI priedas, S3 pav.).Apskritai koronaviruso mutagenezės duomenys labai atitinka EAV NiRAN-RdRp (16) savarankiško GMP ir atvirkštinės genetikos duomenis, kuriuose svarbias funkcijas atlieka EAV nsp9 (koronaviruso nsp12 ortologas) liekana K94 (atitinka HCoV-229E K4135), R124 (atitinka R4178), D132 (atitinka D4188), D165 (atitinka D4280), F166 (atitinka F4281).Be to, HCoV-229E mutagenezės duomenys atitinka ir išplėsti iš anksčiau pateiktų SARS-CoV atvirkštinės genetikos duomenų (16), taip pat labai panašūs į tuos, kurie buvo stebimi atitinkamo CN motyvo Phe-to-Ala mutanto SARS-CoV_nsp12 atveju. aprašytas fenotipas -F219A ir HCoV-229E_F4281A (3 paveikslas D ir E bei SI priedas, S3 pav. ir S1-S4 lentelė).
Palyginti su EAV ortologais (16), kurie aiškiai teikia pirmenybę UTP ir GTP (savaiminio NMPilinimo reakcijos metu), mūsų tyrimas rodo, kad koronaviruso NiRAN domenas (atstovaujamas HCoV-229E ir SARS-CoV-2) gali būti veiksmingas. perdavė Visi keturi NMP, nors šiek tiek pirmenybė teikiama UMP (1 ir 3 pav.).Santykinai mažas specifinio NTP kosubstrato specifiškumas atitinka neseniai praneštą SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompozitinę struktūrą, kurioje ADP-Mg2+ jungiasi prie aktyvios NiRAN vietos, bet ne su adenino dalimi. specifinių sąveikų susidarymo (17).Mūsų tyrime NMPilinimo reakcijoje naudojamas nukleotido tipas neturi skirtingo poveikio mutantinio baltymo aktyvumui (SI priedas, S3 paveikslas), o tai rodo, kad nė viena iš šių liekanų nėra glaudžiai susijusi su konkrečios nukleobazės prisijungimu.Dar reikia ištirti skirtingų NTP ko-substratų pirmenybių, pastebėtų koronavirusų ir arterijų virusų NiRAN domenuose, struktūrinį pagrindą ir galimą biologinę reikšmę;jie gali būti teisingi arba gali atsirasti dėl jų atitinkamų tyrimų apribojimų.Šiuo metu negalima atmesti galimybės, kad potencialus arterinio viruso NiRAN domeno NMPilatoriaus aktyvumas (palyginti su anksčiau apibūdintu savaiminio NMPilinimo aktyvumu) turi skirtingą ko-substrato pasirinkimą, atsižvelgiant į tai, kad arterijos ir koronaviruso panašumas. NiRAN domenas pasiekė savo ribą.Seka pagrįstas palyginimas (16).Palyginti su pseudokinaze SelO, kuri kaip kofaktorių naudoja Mg2+, koronaviruso ir arterinio viruso NiRAN aktyvumas priklauso nuo Mn2+ (16) (3C pav. ir SI priedas, S1 pav.).Priklausomybė nuo Mn2+ ir akivaizdus pirmenybė UTP yra neįprasta baltymų NMPylatorių savybė ir tik neseniai buvo patvirtinta Salmonella typhimurium YdiU baltyme, kuris katalizuoja griežtą nuo Mn2+ priklausomą baltymų chaperono UMPylaciją, kad apsaugotų ląsteles nuo streso indukcijos Ląstelių ATP telkinys ( 33).
Neseniai aprašytas struktūrinis panašumas tarp koronaviruso NiRAN domeno ir ląstelių baltymų kinazių (17, 19) suteikia papildomos paramos NiRAN gebėjimui kovalentiškai susieti NMP su kitais baltymais, apie kuriuos pranešėme šiame tyrime.Galimų NiRAN taikinių paiešką sutelkėme į baltymus, koduojamus HCoV-229E ORF1a, kurie, kaip žinoma, tiesiogiai arba netiesiogiai padeda RTC ORF1b koduotai replikai (12, 35).Mūsų eksperimentai pateikia įtikinamų įrodymų apie veiksmingą ir specifinį nsp9 NMPilinimą (2 pav.).Jei tikslinio baltymo molinis perteklius yra 8–10 kartų didesnis nei fermento (nsp12), patvirtinama, kad nsp9 yra visiškai (mono)NMPizuotas (4 pav.).Padarėme išvadą, kad sąveika tarp nsp12 ir nsp9 yra trumpalaikė ir nesudarys stabilaus komplekso su nsp9 (nesant kitų RTC subvienetų).Šią išvadą patvirtina SARS-CoV proteomo baltymų sąveikos tyrimai (35).MS analizė nustatė, kad nsp9 N-galinės liekanos pirminis aminas yra NMPilinimo vieta (SI priedas, S5 pav.).Fosforamidato jungties ir N-galinės amino grupės susidarymas išskiria NiRAN sukeltą NMPilinimo aktyvumą nuo Pseudomonas syringae SelO tarpininkaujamos AMPilinimo reakcijos, kuri katalizuoja O-sujungto AMP susidarymą Ser, Thr arba Tyr liekanose Peptidų adukte ( 22), o S. typhimurium YdiU sudaro O-susietus (su Tyr) ir N-jungtus (su His) peptido-UMP aduktus.Ribota informacija apie SelO baltymų šeimą rodo, kad šios didelės baltymų šeimos nariai labai skiriasi formuodami peptidų-NMP aduktus.Tai įdomus pastebėjimas, kurį verta toliau tirti.
Šiame tyrime gauti duomenys leido daryti prielaidą, kad nsp9 NMPylacijai reikalingas laisvas N galas.Viruso replikacijos kontekste tai bus suteikta proteolitiniu nsp8|nsp9 apdorojimo vietos skilimu replikaciniame poliproteine pp1a, tarpininkaujant Mpro ir pp1ab.Daugumoje koronavirusų skirtumas tarp šios konkrečios vietos (HCoV-229E VKLQ|NNEI) ir visų kitų koronaviruso Mpro skilimo vietų yra tai, kad Asn (o ne kitos mažos liekanos, tokios kaip Ala, Ser arba Gly) užima P1â???Vieta (36).Ankstyvųjų tyrimų metu gauti peptidų skilimo duomenys parodė, kad nsp8|nsp9 vietos skilimo efektyvumas buvo mažesnis nei kitų vietų, o tai rodo, kad 1) ši specifinė vieta gali turėti reguliavimo vaidmenį laiku koordinuotai apdorojant C-galą. pp1a sritis arba 2) a Specialaus konservuoto nsp9 N-galo vaidmuo viruso replikacijoje (37).Mūsų duomenys (5A pav.) parodė, kad rekombinantinė nsp9 forma, turinti tikrąją N-galinę seką, buvo veiksmingai NMP-paskirta nsp12.N-galo besiribojanti seka buvo pašalinta Xa faktoriumi (nsp9-His6; SI priedas, S1 lentelė) arba Mpro sukeltu skilimu (nsp7-11-His6; 5A pav. ir SI priedas, S1 lentelė).Svarbu tai, kad nesupjaustytas nsp9 turintis pirmtakas nsp7-11-His6 parodė atsparumą nsp12 NMPiliacijai, o tai atitinka mūsų duomenis, o tai rodo, kad nsp9-NMP aduktas susidaro per N-galo pirminį aminą (SI priedas, S5 pav.) .Norėdami giliau suprasti NiRAN substrato specifiškumą, mes sutelkėme dėmesį į gretimas nsp9 N-galo liekanas.Jei nėra kitų baltymų, jie yra struktūriškai lankstūs, todėl jų negalima aptikti nepažymėtoje nsp9 formoje (26 28, 38), o tai rodo ribotą natūralią jų variaciją. Taip yra dėl svarbios sekos specifinės (nesusijusios su antrine struktūra) nsp9 N-galo fragmento funkcija.Konservuotų liekanų Ala pakaitai šiame regione (5C ir D paveikslai bei SI priedas, S8 paveikslas) rodo, kad N3826 yra būtinas nsp9 NMPilacijai in vitro, o N3825A ir E3827A pakaitalai sumažina NMPilinimą, o M3829A ir P3830A pakaitalai nedaro. .Akivaizdu, kad turi įtakos nsp9 NMPylacijai.Nors N-galo Asn (N3825A, N3825S) pakeitimas turi tik nedidelį poveikį nsp9 NMPilacijai ir viruso replikacijai ląstelių kultūroje (5C ir D pav.), Asn liekanos sekos ištrynimas iš N-galo 3825-NN dipeptido. Jis yra mirtinas virusams, o tai rodo, kad prieš kitą likutį N gale reikia vienos Asn liekanos, geriausia Asn, nors atrodo, kad panašių likučių pakeitimas gali būti iš dalies toleruojamas (5B, C ir D pav.).Darome išvadą, kad 3825-NN dipeptidas, ypač konservuota ir esminė N3826 liekana koronaviruso diapazone (SI priedas, S6 pav.), užtikrina teisingą nsp9 N-galo surišimą ir orientaciją aktyvioje NiRAN vietoje.
Visų pošeimių konservuotą Glu pakeitus Ala (E3827A), išlaikomas nsp9 NMPilinimas in vitro, bet yra mirtinas virusams ląstelių kultūroje (5C ir D pav.), o tai rodo papildomą šios liekanos funkciją, pavyzdžiui, pagrindinėse sąveikose (NMPilintas arba nemodifikuotas). ) nsp9 N-galas ir kiti veiksniai, susiję su viruso replikacija.Nsp9 mutacijos neturėjo įtakos nsp9 ar bet kurio gretimo nsp proteolitiniam procesui (39) (SI priedas, S9 pav.), o tai rodo, kad kelių pastebėtų nsp9 mutacijų mirtinus fenotipus sukėlė ne C proteolitinio proceso-galinės pp1a srities reguliavimo sutrikimas. .
Pirmiau pateikti duomenys rodo, kad po Mpro tarpininkaujamo nsp8|9 skilimo vietos apdorojimo pp1a/pp1ab, nsp9 N galas gali būti UMPilintas (arba iš dalies modifikuotas kitu NMP).Be to, puikus nsp9 N-galo išsaugojimas (įskaitant pavienius ir nekintamus Asn likučius koronavirusų šeimoje) ir atvirkštinės genetikos duomenys, gauti šiame tyrime (3E ir 5D paveikslai), leido padaryti išvadą, kad aprašytas nsp9 NMPylavimas. yra biologiškai susijęs ir būtinas koronaviruso replikacijai.Šios modifikacijos funkcinės pasekmės dar turi būti ištirtos, pavyzdžiui, dėl anksčiau aprašyto (nespecifinio) nsp9 (nemodifikuotos formos) RNR surišimo aktyvumo (2628).N-galo NMPilinimas taip pat gali turėti įtakos nsp9 sąveikai su baltymų ar RNR substratais arba skirtingų keturių lygių rinkinių susidarymui.Tai buvo pastebėta atliekant struktūrinius tyrimus ir patvirtinta, kad jie funkciškai susiję su koronaviruso replikacija, nors ypač nesant šios modifikacijos (26–29, 40).
Nors koronaviruso NiRAN domeno tikslinį specifiškumą dar reikia apibūdinti išsamiau, mūsų duomenys rodo, kad koronaviruso NiRAN domeno tikslinio baltymo specifiškumas yra labai siauras.Nors pagrindinių aktyviųjų vietų likučių (8, 16) išsaugojimas visų nidovirusų šeimų NiRAN domene stipriai palaiko konservuotų NMPylator šių baltymų aktyvumą, šio domeno substratą surišančių kišeninių liekanų tapatybė Konservavimas ir išsaugojimas dar turi būti apibūdinti. , ir gali skirtis skirtingose Nidovirales paskirties šeimose.Panašiai dar reikia nustatyti atitinkamus kitų įdėtų virusų taikinius.Jie gali būti nutolę nsp9 ar kitų baltymų ortologai, nes sekos už penkių replikazės domenų, kurios paprastai yra konservuotos įdėtuose virusuose, yra mažiau konservuotos (8), įskaitant genomo masyvą tarp Mpro ir NiRAN. Tarp jų nsp9 yra koronavirusas.
Be to, šiuo metu negalime atmesti galimybės, kad NiRAN domenas turi papildomų (įskaitant korinio ryšio) taikinių.Šiuo atveju verta paminėti, kad šio atsirandančio baltymo NMPylatoriai (NMPylatoriai) (30, 31) bakterijų homologai, atrodo, turi „pagrindinius reguliatorius“?NMP moduliuoja įvairius ląstelių baltymus, kad reguliuotų arba pašalintų jų veiklą pasroviui, taip vaidindamas vaidmenį įvairiuose biologiniuose procesuose, tokiuose kaip ląstelių atsakas į stresą ir redokso homeostazė (22, 33).
Šiame tyrime (2 ir 4 paveikslai ir SI priedas, S3 ir S5 paveikslai) mums pavyko įrodyti, kad nsp12 perkėlė UMP (NMP) dalį į vieną (konservuotą) nsp9 padėtį, o kiti baltymai nebuvo modifikuoti. naudojamas Esant tokioms sąlygoms, palaikomas gerai apibrėžtas (o ne laisvas) substrato specifiškumas.Atsižvelgiant į tai, palyginti su N-galo nsp9 NMPylacija, nsp12 paties NMPilinimo aktyvumas yra labai mažas, jo aptikimui reikalingas ilgesnis autoradiografijos ekspozicijos laikas, o nsp12 koncentracija padidinama 10 kartų.Be to, mūsų MS analizė nepateikė įrodymų apie nsp12 NMPilinimą, o tai rodo, kad NiRAN domeno savęs NMPiliacija yra (geriausiu atveju) antrinė veikla.Tačiau reikia pažymėti, kad kiti tyrimai pateikė preliminarių įrodymų, kad bakterinio NMPylatoriaus savaiminio AMPilinimo būsena gali kontroliuoti jų NMPilinimo aktyvumą kituose baltymų substratuose (22, 33).Todėl reikia atlikti daugiau tyrimų, siekiant ištirti galimą savarankiško NMPilinimo veiklos, apie kurią pranešta EAV nsp9 (16) ir koronaviruso nsp12 (šis tyrimas), funkcinį poveikį, įskaitant siūlomą į chaperoną panašų poveikį C-galo RdRp domeno sulankstymui. 16) ).
Anksčiau buvo svarstomos kelios hipotezės, susijusios su galimomis nidovirusinio NiRAN domeno funkcijomis, įskaitant RNR ligazę, RNR ribojamą guanilato transferazę ir baltymų pradinį aktyvumą (16), tačiau nė viena iš jų nėra suderinama su turimomis pasroviui funkcijomis.Informacija, gauta šiose pozicijose, yra lygiai toks pat laikas, nedarant papildomų prielaidų.Šio tyrimo metu gauti duomenys labiausiai atitinka (bet negali įrodyti), kad NiRAN domenas yra susijęs su baltymų sukeltos RNR sintezės inicijavimu.Anksčiau buvo manoma, kad NiRAN domeno funkcija 5??Šie ir kitų duomenų palaikymas neturi įtakos ²-RNR uždengimo ar RNR surišimo reakcijoms.Todėl, pavyzdžiui, manoma, kad NiRAN aktyvioji vieta apima konservuotą Asp kaip bendrą bazę (D252 Pseudomonas syringae SelO; D4271 HCoV-229E pp1ab; D208 SARS-CoV-2 nsp12) (SI priedas, 2 pav. ).S2) (17, 22, 33), o nuo ATP priklausomos RNR ligazės ir RNR ribojimo fermento katalizę vykdo kovalentinis fermentas-(lizil-N)-NMP tarpinis produktas, kuriame dalyvauja nepakitusi Lys liekana ( 41).Be to, nepaprastas koronaviruso NiRAN seka pagrįstas specifiškumas konservuotiems baltymų taikiniams ir sušvelnintas NTP kosubstratų specifiškumas (pirmiausia UTP) prieštarauja NiRAN tarpininkaujamam ribojamojo fermento arba RNR ligazės tipo funkcijoms.
Akivaizdu, kad reikia daug papildomo darbo, kad būtų patikrintas ir, jei įrodyta, paaiškintas galimas nsp9-UMP (nsp9-NMP) vaidmuo baltymų sukeltoje RNR sintezėje, o tai sujungs keletą įdomių, bet (iki šiol) anksčiau pateiktų ataskaitų. .Pavieniai stebėjimai.Pavyzdžiui, buvo nustatyta, kad neigiamos koronaviruso RNR grandinės pabaiga prasideda oligo(U) grandine (42, 43).Šis pastebėjimas atitinka idėją, kad neigiamos grandinės RNR sintezė inicijuojama UMPilintą nsp9 formą prijungus prie poli(A) uodegos ( trigerių), o tai gali būti skatinama jungiantis RNR. Veikla ir (arba) sąveika su kitas RTC baltymas.Tada UMP dalis, kurią suteikia nsp9, gali būti naudojama kaip nsp7/8/nsp12 tarpininkaujamo oligouridilinimo pradmuo, naudojant genominėje RNR 3??²-poli(A) uodegą arba kitą seką, kurioje yra oligo (A) tarnauja kaip šablonas, panašus į mechanizmą, nustatytą pikornaviruso VPg baltymui (44).Ką daryti, jei pasiūlymas yra „nenormatyvus“????(Baltymų sukeltos) neigiamos grandinės RNR sintezės inicijavimas suteikia nuorodą į stebėjimus, rodančius, kad koronaviruso neigiamos grandinės RNR gale yra UMP (vietoj UTP) (42), o tai rodo, kad Nukleino rūgštis Dicer skaldo galą, fosforilintą nežinomos uridinui specifinės endonukleazės.Jei pasitvirtins, šis nukleorūgščių hidrolizinis aktyvumas gali padėti išlaisvinti oligomerinę UMPiluotą nsp9 formą iš 5 ² besiformuojančios neigiamos grandinės galo.Galimas nsp9 vaidmuo baltymų pridedant taip pat atitinka ankstesnius atvirkštinės genetikos tyrimus, kurie parodė, kad nsp9 (ir nsp8) kritiškai ir konkrečiai sąveikauja su konservuotu cis veikiančiu RNR elementu netoli 3 koronaviruso genomo galo.45).Remiantis šia ataskaita, šie ankstesni stebėjimai dabar gali būti iš naujo išnagrinėti ir išplėsti atliekant tolesnius tyrimus.
Apibendrinant, mūsų duomenys nustatė specifinį patentuoto viruso fermento žymens, susieto su RdRp N-gale, aktyvumą.Sergant koronavirusu, šis naujai atrastas NiRAN tarpininkaujamas UMPylator/NMPylator aktyvumas naudojamas pasikliauti Mn2+ ir gretimomis Asn liekanomis ir sukelti (mažos energijos) fosforamidatinių ryšių su N-galo pirminiu aminu susidarymą.Per Mpro tarpininkaujantį skilimą nsp8|9 skilimo vietoje, nsp9 taikinys gali būti naudojamas NMPilacijai, nurodant funkcinį ryšį tarp proteazės ir NiRAN domeno, kuris tęsiasi iki RdRp.Pagrindinių likučių išsaugojimas nsp12 NiRAN aktyvioje vietoje ir nsp9 taikinyje kartu su duomenimis, gautais iš dviejų koronavirusų, įskaitant SARS-CoV-2, suteikia tvirtų įrodymų, kad nsp9 NMPylation yra koronavirusas. Konservatyvios savybės taip pat yra pagrindinis viruso replikacijos žingsnis.Turimi duomenys leidžia daryti išvadą, kad specifinis NMPilintos nsp9 formos vaidmuo baltymų sukeltoje RNR sintezėje yra pagrįstas koronaviruso ir kitų įdėtų virusų scenarijus, o NiRAN taip pat gali būti nukreiptas į kitus neidentifikuotus baltymus.Reguliuokite virusą.Šeimininko sąveika.Jei pasitvirtins, baltymų pradmenų dalyvavimas viruso RNR sintezėje padidins Mpro/3CLpro ir RdRp domenų sekos afinitetą tarp anksčiau aptikto koronaviruso ir į pikornavirusą panašios supergrupės (9), kurios dabar suvienodintos neseniai sukurtuose Pisonivirituose ( 46) kategorijoje.
Mūsų duomenys taip pat rodo, kad šiame tyrime nustatytas pagrindinis, selektyvus ir konservatyvus fermentų aktyvumas gali būti naudojamas kaip antivirusinių vaistų taikiniai.Junginiai, trukdantys konservuoto nsp9 N-galo prisijungimui (ir vėlesniam modifikavimui) aktyvioje NiRAN vietoje, gali būti sukurti į veiksmingus ir universalius antivirusinius vaistus, tinkamus gyvūnų ir žmonių koronavirusams iš skirtingų (po)genties infekcijų gydyti. , įskaitant SARS-CoV-2 ir Artimųjų Rytų kvėpavimo sindromo koronavirusą.
Šiame tyrime gauto koronaviruso baltymo kodavimo seka buvo amplifikuota RT-PGR, naudojant RNR, išskirtą iš Huh-7, užkrėsto HCoV-229E arba Vero E6, užkrėsto SARS-CoV-2, ir įterpta naudojant standartines klonavimo procedūras.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) arba pASK3-Ub-CHis6 (47) ekspresijos vektorius (SI priedas, S1 ir S2 lentelės).Vieno kodono pakaitalai buvo įvesti naudojant PGR pagrįstą vietinę mutagenezę (48).Norint pagaminti MBP sulietą baltymą, E. coli TB1 ląstelės buvo transformuotos atitinkama pMAL-c2 plazmidės konstrukcija (SI priedas, S1 lentelė).Sulietas baltymas buvo išgrynintas amilozės afiniteto chromatografija ir suskaldytas faktoriumi Xa.Vėliau C-galo His6 pažymėtas baltymas buvo išgrynintas Ni-imobilizuoto metalo afiniteto chromatografija (Ni-IMAC), kaip aprašyta anksčiau (49).Ubikvitino sulietam baltymui gaminti E. coli TB1 ląstelės naudojo atitinkamą pASK3-Ub-CHis6 plazmidės konstrukciją (SI priedas, S1 ir S2 lentelės) ir pCGI plazmidės DNR, koduojančią ubikvitinui specifinę C-galinę hidrolazę 1 (Ubp1).Transformacija (47).C-galo His6 pažymėtas koronaviruso baltymas buvo išgrynintas, kaip aprašyta anksčiau (50).
HCoV-229E nsp12-His6 savaiminio NMPilinimo testas buvo atliktas taip, kaip aprašyta EAV nsp9 (16).Trumpai tariant, nsp12-His6 (0,5 µM) yra 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonrūgšties (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitolio (DTT), 6 mM MnCl2, buferio, 25 µM. nurodytas NTP ir 0,17 µM atitiko [α32-P]NTP (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C temperatūroje 30 minučių.Visuose kituose (standartiniuose) nsp12 tarpininkaujamo nsp9 NMPilinimo NMPilinimo tyrimuose reakcijos sąlygos koreguojamos taip: nsp12-His6 (0,05 µM) ir nsp9-His6 (4 µM), dalyvaujant 50 mM HEPES-KOH (pH 8). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM nurodytas NTP ir 0,17 µM atitiko [α32-P]NTP.Po 10 minučių inkubacijos 30 °C temperatūroje reakcijos mėginys buvo sumaišytas su SDS-PAGE mėginio buferiu: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometano HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerolio ir 0,005% bromofenolio. mėlyna.Baltymas buvo denatūruotas kaitinant 90 ° C temperatūroje 5 minutes ir atskirtas 12% SDS-PAGE.Gelis fiksuojamas ir nudažomas Coomassie Brilliant Blue tirpalu (40 % metanolio, 10 % acto rūgšties, 0,05 % Coomassie Brilliant Blue R-250), nuspalvina ir 20 valandų eksponuojamas fosforescenciniame vaizdo ekrane (nsp12 aptikimui iš NMPilinimo). arba (daugiausia) 2 valandas (nsp9 NMPylacijai įvertinti).Ekranui nuskaityti buvo naudojamas Typhoon 9200 vaizdo įrenginys (GE Healthcare), o signalo intensyvumui analizuoti – ImageJ.
MS analizei NMPilinimo analizėje buvo naudojami 1 µM nsp12-His6 ir 10 µM nsp9 (be heksahistidino žymės) (SI priedas, S1 lentelė), o padidinta 500 µM UTP ir GTP koncentracija.Atsižvelgiant į jų koncentraciją ir numatomą baltymų kokybę, Waters ACQUITY H klasės HPLC sistema su MassPrep kolonėlė (Waters) buvo naudojama 1–10 µL buferinių baltymų tirpalų nudruskinimui internetu.Išsūdytas baltymas eliuuojamas į Synapt G2Si masės spektrometro (Waters) elektropurškimo jonų šaltinį per tokį buferio A (vanduo/0,05 % skruzdžių rūgštis) ir buferio B (acetonitrilas/0,045 % skruzdžių rūgštis) gradientą, o kolonėlės temperatūra yra 60 °C ir 0,1 ml/min srauto greitis: eliuavimas izokratiškai su 5% A 2 minutes, tada tiesinis gradientas iki 95% B per 8 minutes ir 95% B palaikymas dar 4 minutes.
Aptinkami teigiami jonai, kurių masės diapazonas yra nuo 500 iki 5000 m/z.Glu-fibrinopeptidas B matuojamas kas 45 sekundes automatiniam masės dreifo korekcijai.Naudokite MassLynx prietaiso programinę įrangą su MaxEnt1 plėtiniu, kad išskaidytumėte vidutinį spektrą, atėmus bazinę liniją ir išlyginimą.
UMPilintas HCoV-229E nsp9 buvo virškinamas pridedant sekos laipsnio modifikuoto tripsino (Serva) ir inkubuojamas per naktį 37 ° C temperatūroje.Chromabond C18WP sukimo kolonėlė (dalies numeris 730522; Macherey-Nagel) buvo naudojama peptidams nusūdyti ir koncentruoti.Galiausiai peptidas buvo ištirpintas 25 µl vandens, kuriame buvo 5% acetonitrilo ir 0,1% skruzdžių rūgšties.
Mėginiai buvo analizuojami MS naudojant Orbitrap Velos Pro masės spektrometrą (Thermo Scientific).Aukščiausia nanoâ HPLC sistema (Dionex), įrengta pagal užsakymą montuojama 50 cm?75 μm C18 RP kolonėlė su 2,4 μm magnetinėmis granulėmis (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Prijunkite prie masės spektrometro internetu per Proxeon nanopurškimo šaltinį;įšvirkškite 6 µL tripsino skaidymo tirpalo į 300 µm vidinį skersmenį ×??1 cm C18 PepMap išankstinio koncentravimo kolonėlė (Thermo Scientific).Naudojant vandenį / 0,05% skruzdžių rūgštį kaip tirpiklį, mėginys buvo automatiškai sulaikomas ir gėlinamas 6 µl/min srauto greičiu.
Triptiniams peptidams atskirti 300 nL/min srauto greičiu buvo naudojami šie vandens/0,05 % skruzdžių rūgšties (tirpiklis A) ir 80 % acetonitrilo/0,045 % skruzdžių rūgšties (tirpiklis B) gradientai: 4 % B 5 minutes, tada 30 A tiesinis gradientas iki 45 % B per kelias minutes ir tiesinis padidėjimas iki 95 % tirpiklio B per 5 minutes.Prijunkite chromatografinę kolonėlę prie nerūdijančio plieno nanospinduliuotojo (Proxeon) ir purškite eliuentą tiesiai į įkaitintą masės spektrometro kapiliarą, naudodami 2 300 V potencialą. Susietas tyrimo skenavimas su 60 000 skiriamąja geba Orbitrap masės analizatoriuje. su mažiausiai trimis duomenimis MS/MS skenavimus, dinamiškai neįtraukiamus 30 sekundžių, naudojant tiesinę jonų gaudyklių susidūrimo sukeltą disociaciją arba didesnės energijos susidūrimo disociaciją kartu su orbitrap aptikimu, skiriamoji geba yra 7500.
Paskelbimo laikas: 2021-03-03